蛋白質(zhì)提純技術(shù)簡介

1.逐級鹽析 高鹽情況下由于與蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)作用的水分子減少而使得蛋白質(zhì)溶解度下降的現(xiàn)象稱為鹽析效應(yīng)。不同蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)分布的不同決定對鹽析效應(yīng)的反應(yīng)不同。如50％飽和度的硫酸銨能夠沉淀血清中的抗體分子IgG，但是血清中其他類型的蛋白質(zhì)需要更高的硫酸銨濃度才能被鹽析。逐級鹽析通常在蛋白質(zhì)初步分離中用到。核酸在高鹽溶液中不沉淀，所以鹽析也是濃縮蛋白的同時去除蛋白質(zhì)制各液中高豐度核酸污染源的好方法。常規(guī)的操作是：在常溫攪拌的情況下慢慢加入飽和的硫酸銨溶液到初始上清液當(dāng)中直到飽和度達(dá)到20％，然后把樣品放在冷庫4～6個小時后再離心。如此重復(fù)可得到在20％，40％，60％和80％硫酸銨飽和度情況下沉淀的蛋白質(zhì)。各個組分的蛋白質(zhì)可以在重新溶解和透析后檢測目標(biāo)蛋白的位置以指導(dǎo)下一步的提純。

注：硫酸銨的飽和度在常溫(24℃)和冷庫(4℃)間變化很小，都是4. lM左右(在1L純凈水中溶解761g硫酸銨晶體)。

2.親和層析 親和層析是基于目標(biāo)蛋白和固相交聯(lián)的載體之間的相互作用而設(shè)計的純化策略。如可以利用含固相交聯(lián)抗體的親和柱純化可與之作用的對應(yīng)的抗原分子。另外，基于很多轉(zhuǎn)錄因子有對DNA特殊序列的親和性，親和層析也被廣泛地應(yīng)用于純化轉(zhuǎn)錄因子的策略中：把含有和目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子相互作用的DNA序列交聯(lián)在活化瓊脂糖固相柱上可以純化對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于每一步的純化倍數(shù)會很高，通常是上百倍或千倍。如果是基于抗體-抗原作用的親和層析，被吸附的蛋白質(zhì)可以用低pH、高pH或含尿素溶液(干擾抗體-抗原作用)洗脫；被吸附在DNA的轉(zhuǎn)錄因子則可以用含高鹽緩沖液洗脫。

3.凝膠過濾層析 凝膠過濾層析又叫分子篩層析，是基于蛋白質(zhì)天然分子量大小而設(shè)計的分離方法。分子篩的作用使得分子量小的蛋白質(zhì)在層析過程中在柱子上滯留的時段比較長。所以。個特定蛋白質(zhì)或復(fù)合體被洗脫所需的溶液體積與其天然分子量成負(fù)相關(guān)。這種方法不僅在初級或次級分離中是很好的手段，也可以與已知分子量的對照蛋白平行使用來測定純化蛋白質(zhì)的天然分子量。

4.離子交換層析 離子交換層析是zui常用的基于蛋白質(zhì)與載體吸附作用而設(shè)計的蛋白質(zhì)分離方法。蛋白質(zhì)是表面帶有多離子基團(tuán)的大分子。離子交換層析足以離子交換劑為固定相，以特定的含蛋白質(zhì)和溶液離子的緩沖液為流動相，利用離子交換劑對需要分離的各種蛋白質(zhì)結(jié)合力的差異，而將混合物中不同解離特性蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的層析技術(shù)。此方法具有靈敏度高，重復(fù)性與選擇性好和分離速度快等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)離子交換劑所帶電荷的不同，可分為陰離子交換劑和陽離子交換劑。以陰離子交換層析為例：將交換樹脂(因?yàn)榻粨Q劑能在溶液中釋放出OH基團(tuán)所以本身帶正電荷)填充在層析柱內(nèi)，表面帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會被吸附；由于各種蛋白質(zhì)表面所帶電荷的種類和數(shù)量不同，它們被吸附的程度也不同。然后用含陰離子(如KCl中的Cl)梯度的緩沖溶液洗柱，蛋白質(zhì)可依次從含電荷少到多的順序被洗脫下來而達(dá)到分離的目的。

5.疏水作用層析 疏水作用層析也屬于吸附層析一類。該方法基于蛋白質(zhì)的疏水差異，適用于不易被鹽析蛋白質(zhì)的進(jìn)一步提純。在高鹽溶液中，蛋白質(zhì)表面的親水／離子基團(tuán)被反離子所遮蓋，而表面的疏水基團(tuán)會與疏水層析柱中的疏水配基相結(jié)合。通常而論，鹽濃度越高，蛋白與層析柱的疏水配基相結(jié)合形成的疏水鍵越強(qiáng)。如在2. 5M硫酸銨條件下能被鹽析的蛋白質(zhì)可以溶解在含2M硫酸銨的緩沖液中加樣。在洗脫時，將鹽濃度逐漸降低(如建立2M到40mM硫酸銨梯度)，不同蛋白質(zhì)因疏水性不同而先后被洗脫而純化。

注：疏水層析與離子交換層析剛好互補(bǔ)，因此可以用于分離離子交換層析或其他方法很難或不能分離的蛋白質(zhì)。

6.反相層析 在上面所講的吸附層析特別是離子交換層析中都會出現(xiàn)高極性物質(zhì)在層析柱上吸附較牢從而發(fā)生洗脫時的拖尾現(xiàn)象和在柱中滯留時間過長的問題。反相層析是在固相載體上涂上一層高碳原子的疏水性強(qiáng)的烷烴類，而洗脫液則用極性強(qiáng)的溶劑，如甲醇和水的混合物。被分離的粗蛋白質(zhì)樣品中，極性強(qiáng)的蛋白質(zhì)不容易被吸附，所以能zui先洗脫下來從而得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反，所以被稱為反相層析。從本質(zhì)上看，反相層析分離法與疏水層析分離法的依據(jù)是一致的，都是利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動相中包括蛋白質(zhì)表面的一些疏水基團(tuán)發(fā)生可逆性結(jié)合而進(jìn)行分離。反相層析的優(yōu)點(diǎn)是分辨率好。圖4-3-2是例樣。