細(xì)胞生長的檢查方法（二）

1.檢測細(xì)胞代謝活性

檢測細(xì)胞的代謝活性也可以反映細(xì)胞增殖的情況。在細(xì)胞增殖過程中乳酸脫氫酶的活性會增加，而活性的脫氫酶可以使得外源性的四唑鹽或者阿爾瑪藍(lán)(Alamar blue)還原成為帶有顏色還原產(chǎn)物。通過分光光度計(jì)或者酶標(biāo)儀來讀取含染料培養(yǎng)基的吸光度，從而衡量細(xì)胞的代謝活性，檢測細(xì)胞增殖的情況。

四種zui常見的四唑鹽是：MTT、XTT、MTS和WST1，其還原產(chǎn)物為甲瓚(formazan)。

(1)四甲基偶氮唑鹽法(MTT)：MTT商品名為噻唑藍(lán)，是一種黃色的染料。1983年Mosmann建立MTT比色法，用于檢測細(xì)胞存活和增殖。其原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶，甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死亡的細(xì)胞無此功能。二甲亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫分析儀測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。MTT可以用于所有細(xì)胞類型，但MTT在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)基中是不溶的，而且其生成的甲瓚晶體需要溶解在DMSC)中。因此，MTT主要作為終點(diǎn)檢測方法。另外，有研究發(fā)現(xiàn)過氧化物會降低MTT測定的準(zhǔn)確度，抑制將近95％，的MTT與O₂^-的反應(yīng)，MTT溶解產(chǎn)物甲瓚會吸附在納米纖維上，而致使檢測的結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。

(2)二甲氧唑黃比色法(XTT)：XTT是一種與MTT類似的四唑氮衍生物，可被活細(xì)胞還原形成水溶性的橘黃色的甲瓚產(chǎn)物，不形成顆粒，可直接用酶聯(lián)免疫分析儀檢測吸光度，故較MTT法更加快速、簡便、敏感。

但XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。由于XTT的代謝產(chǎn)物呈橘黃色，故培養(yǎng)體系中有些黃色代謝物和試劑可能會影響其檢測結(jié)果。與MTT一樣，過氧化物可抑制近95％的XTT與O₂^-的反應(yīng)，故對XTT測定的準(zhǔn)確度有一定的影響。

(3)內(nèi)鹽法(MTS)：MTS是一種新型的MTT類似物。MTs在偶聯(lián)劑PMS存在的條件下，可被活細(xì)胞線粒體中的多種脫氫酶還原成水溶性的有色甲瓚產(chǎn)物，其顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)量在一定范圍內(nèi)呈高度相關(guān)，可用酶標(biāo)儀檢測。它的優(yōu)點(diǎn)在于無放射性、快速、安全、方便、靈活及特異性強(qiáng)，同時又克服了MTT、XTT的缺點(diǎn)。

(4)四唑單鈉鹽法(WST-1)：WST-1是水溶性四唑鹽試劑，是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。WST-1是MTT的一種升級替代產(chǎn)品，和MTT或其他MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。首先，MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的甲瓚不是水溶性的，需要由特定的溶解液來溶解：而WST-1和XTT、MTS產(chǎn)生的甲瓚都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-1產(chǎn)生的甲瓚比XTT和MTS產(chǎn)生的甲瓚更易溶解。再次，WST-1比XTT和MTS更加穩(wěn)定，加入WST-1顯色后，可以在不同時間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板，使檢測時間更加靈活，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定。另外，WST-1和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高。

(5)Cell countjn譬kit-8(CCK-8)：CCK-8試劑中含有WST-8。WST-8是近年新開發(fā)的一種較WST-1更新的水溶性四唑鹽，檢測原理與WST-1類似，但較WST-1更穩(wěn)定，靈敏度更高，溶解性更強(qiáng)，更易于保存。CCK-8檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的靈敏度比MTT、XTT及MTS更高，尤其適合于懸浮細(xì)胞，高通量藥物篩選。CCK-8法細(xì)胞毒性低，細(xì)胞檢測后還可重復(fù)利用，具有更好的實(shí)用性，可替代MTT法，具有良好的應(yīng)用前景。

(6)阿爾瑪藍(lán)法：阿爾瑪藍(lán)檢測試劑為細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測提供了一種簡便、快速、可靠、安全的方法。阿爾瑪藍(lán)在氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)紫藍(lán)色無熒光性，而在還原狀態(tài)下轉(zhuǎn)變?yōu)槌史奂t或紅色熒光的還原產(chǎn)物，可以用普通分光光度計(jì)或熒光光度計(jì)進(jìn)行檢測，吸光度和熒光強(qiáng)度與活性細(xì)胞數(shù)成正比。阿爾瑪藍(lán)對細(xì)胞無毒、無害，不影響細(xì)胞代謝、細(xì)胞因子分泌、抗體合成等，可以對同一批細(xì)胞的生長狀態(tài)進(jìn)行連續(xù)觀察和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

MTT可以用于所有細(xì)胞類型，但MTT在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)基中是不溶的，而且其生成的甲瓚晶體需要溶解在DMSO中。因此，MTT主要作為終點(diǎn)檢測方法。其他三種鹽與阿爾瑪藍(lán)一樣，都是可溶且無毒的。它們可以作為連續(xù)監(jiān)控手段來跟蹤細(xì)胞增殖的動態(tài)改變。其中XTT的效率較低，需要添加額外的因子。而WST-1更靈敏有效，與其他鹽相比能夠更快顯色。阿爾瑪藍(lán)的靈敏度也很高，只要微孔板的孔中有100個細(xì)胞它就能夠檢測到。四唑鹽和阿爾瑪藍(lán)氧化還原染料能夠用于多種儀器和高通量研究，非常方便。

2.檢測ATP含量

ATP是細(xì)胞能量的直接來源，細(xì)胞內(nèi)的ATP含量受到嚴(yán)格的調(diào)控，死亡細(xì)胞或即將死亡的細(xì)胞幾乎不舍ATP，在細(xì)胞溶解物或提取物中測得的ATP濃度與細(xì)胞數(shù)之間存在嚴(yán)格的線性關(guān)系。因此，檢測ATP也可以得到細(xì)胞增殖的信息。

ATP檢測可以用成色反應(yīng)、熒光、化學(xué)發(fā)光或同位素等方法實(shí)現(xiàn)。目前應(yīng)用zui廣的方法基于螢火蟲熒光素酶(催化熒光素氧化，消耗ATP。如果有ATP存在，則熒光素就會發(fā)光，發(fā)光效率*，發(fā)光量與ATP含量呈很好的線性關(guān)系，可以反映細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。

3.活細(xì)胞熒光標(biāo)記

羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，CFSE能夠輕易穿透細(xì)胞膜，在活細(xì)胞內(nèi)聚積并與胞內(nèi)蛋白共價結(jié)合，水解后的CFSE釋放出熒光物質(zhì)，這些共價結(jié)合的熒光物分子很少從細(xì)胞內(nèi)脫落。CFSE標(biāo)記后的細(xì)胞用于體內(nèi)觀察可以長達(dá)數(shù)周。當(dāng)細(xì)胞分裂時，CFSE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半。這樣，在一個增殖的細(xì)胞群體，各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度呈對數(shù)遞減，利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測通道可對其進(jìn)行分析。

4.增強(qiáng)標(biāo)記檢測

增殖細(xì)胞特異性地表達(dá)某些特定蛋白，利用特異性的單抗來識別這些增殖細(xì)胞。例如，在人體細(xì)胞中，Ki-67，PCNA等可以作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志。但是，由于需要組織切片，這種方法無法進(jìn)行高通量分析。不過這一方法頗受癌癥研究者們的青睞，因?yàn)樗軌蛴脕頇z測體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖。